Annexin V-FITCPI凋亡檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明

保存方式
4℃避光可保存12個(gè)月。

操作說(shuō)明
1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：
a) 懸浮細(xì)胞：
1）收集細(xì)胞?離?管中1000-2000rpm離心5min，小心去除上清。
2）用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
3）再加?1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
b) 貼壁細(xì)胞：
1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液至離?管中，PBS洗滌貼壁細(xì)胞?次，加?適量不含EDTA的細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。
2）室溫孵育?輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)時(shí)，吸除細(xì)胞消化液。需避免的過(guò)度消化。
3）加?以上步驟中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離?管內(nèi)，1000-2000rpm離?5min，??吸除上清。
注：加?的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)?凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的?清可以有效抑制或中和殘留的；殘留的會(huì)消化并降解后續(xù)加?的 Annexin V-FITC 導(dǎo)致染?失敗。
4）?1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
5）再加?1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

2. ?去離??按1：4稀釋 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml去離??）；
3. 用 250ul結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml；
4. 取100ul的細(xì)胞懸液于5 ml流式管中，加入5ul Annexin V-FITC，輕輕混勻；
5. 室溫(20-25℃)避光孵育10min；
6. 上機(jī)前5min加?10ul碘化丙啶溶液，輕輕混勻；
7. 上機(jī)前在反應(yīng)管中補(bǔ)加400ul PBS重懸細(xì)胞，避光保存，隨即進(jìn)?流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)， Annexin V-FITC為綠?熒光，PI為紅?熒光。如使用熒光顯微鏡，可直接觀察。

產(chǎn)品描述
磷脂酰（PS）是?種帶負(fù)電荷的磷脂，正常細(xì)胞中，PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，?在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細(xì)胞膜外側(cè)，使PS暴露在細(xì)胞膜外表?。Annexin V是?種分?量為35~36kD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋?，與磷脂酰有?度親和?，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被*為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之?。

本試劑盒將Annexin V進(jìn)?綠?熒光（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為探針，利?熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)?。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是?種核酸染料，它不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜?使細(xì)胞核染紅。因此采?Annexin V與PI雙染的?法，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

注意事項(xiàng)：
1. 微量試劑需離?數(shù)秒將試劑收集?管底后再開(kāi)蓋取?。
2. Propidium Iodide（PI）、Annexin V-FITC有毒，操作時(shí)要帶?套，使?時(shí)避免與?膚，眼睛和黏膜接觸。
3. 本試劑盒?于檢測(cè)活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1x106。
4. 染?后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過(guò)?可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
5. Annixin V檢測(cè)凋亡細(xì)胞的?法適?于懸浮??的細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測(cè)。對(duì)于貼壁??的細(xì)胞，由于在等消化處理過(guò)程中會(huì)造成細(xì)胞膜的損傷，會(huì)造成較?的假陽(yáng)性，而用細(xì)胞刮子會(huì)造成細(xì)胞粘連成團(tuán)，從而影響檢測(cè)，可消化后的細(xì)胞保存在含2%BSA的PBS中，防?進(jìn)?步的損傷。盡管?前，包括國(guó)外也有?些單位采?該?法檢測(cè)貼壁??的細(xì)胞。但不推薦，因?yàn)槠渲貜?fù)性較差，且需要操作時(shí)?常??。
6. .細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請(qǐng)不要固定樣品。
7. .如果樣品來(lái)源于血液，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200g離心洗去血小板。

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