RT-PCR實(shí)驗(yàn)操作流程

信帆生物提供 PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)，RT-PCR代測(cè)?？蛻糁恍枰峁颖?，其他所有試劑都由本公司提供。一般7-10天出結(jié)果，提供原始數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)室所用儀器型號(hào)，圖片，動(dòng)力擴(kuò)增曲線等。

RT-PCR實(shí)驗(yàn)外包，mRNA、miRNA、lncRNA、DNA實(shí)驗(yàn)代測(cè)

服務(wù)內(nèi)容：

1.制定個(gè)性化實(shí)驗(yàn)方案：根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定實(shí)驗(yàn)方案、選定合適的內(nèi)參；
2.檢測(cè)類別：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；
3.樣本抽提及質(zhì)檢：對(duì)客戶提供樣本進(jìn)行RNA抽提，并利用NanoDrop進(jìn)行樣本質(zhì)檢；
4.定量PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)：包括樣本反轉(zhuǎn)錄為CDNA、配置PCR反應(yīng)體系及進(jìn)行Real-TimePCR反應(yīng)；
5.正式定量PCR實(shí)驗(yàn)：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)；
6.數(shù)據(jù)分析：采用2- △△CT法進(jìn)行分析，比較不同樣本間差異。

服務(wù)要求：
1.請(qǐng)?zhí)峁┙M織樣本，細(xì)胞樣本，血漿或血清樣本，totalRNA；
2.請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列或GeneBank號(hào)；
3.請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA來源、基因豐度等。

結(jié)果內(nèi)容：整理好的報(bào)告，樣本收到之日起5個(gè)工作日內(nèi)反饋質(zhì)檢結(jié)果。

結(jié)果展示：

樣本質(zhì)檢圖

溶解曲線：

擴(kuò)增曲線

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)指標(biāo)有2張圖。一張是擴(kuò)增曲線，另一張是熔解曲線，用來證明PCR擴(kuò)增中無非特異性擴(kuò)增

送樣運(yùn)輸要求：

1. 樣品處理

a. 動(dòng)物組織：常規(guī)組織，脂肪組織，結(jié)締組織，纖維化組織適當(dāng)增加。將組織剪切成合適大小后（建議組織塊長(zhǎng)寬高均不大于0.5 cm），然后迅速浸泡于5～10倍體積的RNAsolidTM試劑中。（注意：已浸入RNAsolidTM試劑中的組織經(jīng)平衡一段時(shí)間后，可從溶液中取出，切成更小的組織塊，再重新放回RNAsolidTM試劑中；有些比較弱的液體滲透性組織如骨頭等，不適合用RNAsolidTM試劑進(jìn)行RNA保護(hù)。）

b.植物組織：新鮮的葉、果肉、種子最少100 mg。將嫩葉，嫩莖組織切成合適的大小（建議長(zhǎng)寬高均不大于0.5 cm）后，然后迅速浸泡于5～10倍體積的RNAsolidTM試劑中。（注意：某些植物組織天生具有的屏障，如葉子表面的蠟層可阻礙RNAsolidTM試劑的滲透，對(duì)于此類組織，通常需破壞這些屏障層以允許溶液的浸透。）

c.細(xì)胞等樣本：收集不小于10^6個(gè)細(xì)胞的沉淀（用PBS清洗1-2次）。之后迅速加入5～10倍體積的RNAsolidTM試劑。

d.酵母、細(xì)菌等樣本：離心棄上清，收集小米粒大小的單菌體沉淀，然后迅速加入適量的RNAsolidTM試劑浸沒菌體沉淀。
e. RNA樣品： OD260/280為1.8-2.0，濃度≥100 ng/μL，體積≥20μL，干冰運(yùn)輸。

f.cDNA：cDNA原液≥20 μL，干冰運(yùn)輸。

Real -Time PCR，即實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法，它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并通過Real -Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，終對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理的方法。Real -Time PCR自1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出以來，廣泛應(yīng)用于生物研究的各個(gè)領(lǐng)域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探針法兩種。

PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)，熒光定量PCR代測(cè)服主要儀器及耗材
旋渦振蕩器 ：上海青浦瀘西儀器廠產(chǎn)品
手握式電動(dòng)勻漿機(jī)：德國(guó)FLUKO 公司產(chǎn)品
低溫冷凍離心機(jī)：Sigma（3K15）公司產(chǎn)品
Real-time檢測(cè)儀：ABI （ABI-7300）公司產(chǎn)品
超純水分離系統(tǒng)：美國(guó)LABCONCO公司
離心管及10μL、200μL、1000μL槍頭等常規(guī)耗材均為國(guó)產(chǎn)；RNA提取過程中所需的離心管、槍頭等耗材經(jīng)過0.1%的DEPC水浸泡過夜，121℃滅菌30min，烘干后備用。

PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)，熒光定量PCR代測(cè)服實(shí)驗(yàn)室試劑的操作
1)所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
2)所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。
3)在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮NA一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮NA不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。
4)所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。
5)所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
6)新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。
7)樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。

本程序適用于自動(dòng)PCR操作，可適用于大多數(shù)情況，所用酶是不含核酸外切酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶，如Taq聚合酶等。
引物（各50pmol） 0.2mmol/L dNTPs（必須使用高質(zhì)量的dNTPs，這一點(diǎn)非常重要。dNTPs經(jīng)反復(fù)化凍后會(huì)發(fā)生降解，因此應(yīng)分成小份保存。應(yīng)注意混合物中四種dNTP的量要相等） 模板DNA：約0.05～1mg基因組DNA或0.002～0.02mg質(zhì)粒DNA Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut） 10×PCR緩沖液（500mmol/L KCl，15mmol /L MgCl₂，100mmol/L Tris·HCl，pH 8.3） 礦物油
電泳所需試劑
【儀器設(shè)備】
PCR擴(kuò)增儀
電泳裝置
微量離心機(jī)
微量移液器（1～20ml和20～200ml）
0.5ml Eppendorf 管
紫外線觀察裝置及照相設(shè)備

操作程序

1．在無菌的Eppendorf管內(nèi)加入以下反應(yīng)物：

2．93℃ 反應(yīng)2 min后開始以下循環(huán)：
93℃變性反應(yīng)1 min；
50℃退火反應(yīng)1 min；
72℃延伸反應(yīng)3 min。
經(jīng)過17～35循環(huán)后，后一個(gè)循環(huán)72℃增加5 min。循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于40℃保存。
3．取1～5ml反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色檢測(cè)擴(kuò)增的情況。

應(yīng)注意的問題及其解決方法

1．PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
要優(yōu)化特定的PCR反應(yīng)，有必要試用不同的反應(yīng)組分和循環(huán)參數(shù)。表2-1列出了添加或改變某一試劑濃度對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響，從中大家可以得到一些線索以改進(jìn)反應(yīng)條件，提高PCR產(chǎn)量和/或特異性，一般情況下，只須改變一兩個(gè)參數(shù)就行了，如pH值和MgCl₂濃度。表2-2給出了循環(huán)參數(shù)對(duì)PCR結(jié)果的影響。
表2-1 PCR各反應(yīng)組分濃度對(duì)產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量的影響

* 效果可能不可預(yù)測(cè)
** 添加10% DMSO時(shí)，Taq DNA聚合酶的活性會(huì)被抑制47%，因此反應(yīng)加大Taq DNA聚合酶的用量（即5U）予以補(bǔ)償
*** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
表2-2 可改變以提高PCR產(chǎn)物的特異性和/或產(chǎn)量的循環(huán)參數(shù)

* 使用基因組DNA作模板時(shí)，開始幾個(gè)循環(huán)變性應(yīng)于97℃進(jìn)行
** 假定Tm值為60℃
*** 延伸時(shí)間依產(chǎn)物大小而定：1000bp的產(chǎn)物延伸30s即可，產(chǎn)物更長(zhǎng)時(shí)，按每1000 bp延伸0.5 min計(jì)，在后期循環(huán)中增加延伸時(shí)間可以提高擴(kuò)增效率
2．引物的設(shè)計(jì)
毫無疑問，引物的堿基組成，長(zhǎng)度及其靶序列的同源性是決定PCR成敗的首要因素，選擇設(shè)計(jì)引物在一定程度上仍然要靠經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于某一對(duì)引物而言尚無通用的規(guī)則可嚴(yán)，但應(yīng)遵守以下原則：
（1）一般性原則：
①長(zhǎng)度：15～30bp，其有效長(zhǎng)度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38，否則PCR的適延伸溫度會(huì)超過Taq酶的佳作用溫度（74℃），從而降低產(chǎn)物的特異性。
②G＋C含量：應(yīng)在45%～55%之間，PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5～10度。引物長(zhǎng)度小于20時(shí)，其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。
③ 堿基分布的隨機(jī)性：應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)3個(gè)的連續(xù)的G或C，否則會(huì)使引物在G＋C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。
④ 引物自身：不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。
⑤引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，不然會(huì)形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。
⑥特異性：與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于70%，或少于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基。
（2）引物的3’端：
引物的3’端很大程度上影響Taq酶的延伸效應(yīng)，除特殊情況（AS-PCR）外，3’端不應(yīng)發(fā)生錯(cuò)配。S. Kwok等發(fā)現(xiàn)，引物的3’端發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，A:A使產(chǎn)量下降至1/20，A:G或C:C下降至1/100。當(dāng)末位堿基是T時(shí)，即使錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的合成，而為A時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率低，G、C居間。
因此，引物的3’端堿基好選用A、G、C，而盡可能地避免選用T，尤應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)2個(gè)以上的T。
此外，如果擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物的3’端不要終止于密碼子的第3位，因此處易發(fā)生簡(jiǎn)并，從而影響擴(kuò)增特異性。
（3）避開引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)：
某些引物無效的原因是引物重復(fù)區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，因此選擇擴(kuò)增片段時(shí)應(yīng)注意避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，有些計(jì)算機(jī)軟件可幫助確定該區(qū)域，如不能避開，則可用7- deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP，有助于PCR成功。
目前在引物選擇中已廣泛應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件，從EMBL或Genebank中查找有關(guān)基因序列，并依據(jù)上述原則對(duì)所選用引物進(jìn)行評(píng)價(jià)。
3．出現(xiàn)異常結(jié)果時(shí)的解決思路
在做PCR反應(yīng)的過程中，由于其酶促反應(yīng)的本質(zhì)，影響終結(jié)果的因素較多，所以出現(xiàn)一些非預(yù)料的結(jié)果是可以理解的。下面簡(jiǎn)單地總結(jié)一下在PCR反應(yīng)結(jié)果出現(xiàn)異常時(shí)我們應(yīng)該采取的措施。
（1）電泳檢查沒有 PCR產(chǎn)物
a．需檢查一下Taq DNA聚合酶是否失活，或是活性太低，還需查一下在加樣過程中是否向體系中加過Taq DNA聚合酶；
b．需檢查一下所使用的引物，看其序列設(shè)計(jì)是否正確，是否堿基組成不平衡；
c．需要檢查一下PCR反應(yīng)過程中模板是否變性充分，尤其在前幾個(gè)循環(huán)中是否變性充分；可以適當(dāng)?shù)靥岣吣０遄冃缘臏囟然蚴沁m當(dāng)延長(zhǎng)變性的時(shí)間；
d．需檢查一下在PCR反應(yīng)體系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制劑，如SDS污染等等；
e．需檢查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染，可以預(yù)先加熱使之失活。
（2）電泳檢查出現(xiàn)引物二聚體區(qū)帶
a．需檢查一下兩個(gè)引物的3’端是否互補(bǔ)，或者是否有相類似的回文結(jié)構(gòu)；
b．需檢查一下使用的引物是否太短，可以予以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)；
c．需檢查模板的用量，模板以10－4個(gè)拷貝為佳，模板太少會(huì)造成引物相對(duì)過量；
d．適當(dāng)?shù)亟档鸵锏臐舛?，引物濃度過高是出現(xiàn)引物二聚體的主要原因；
e．循環(huán)次數(shù)太多也易形成引物二聚體，可以適當(dāng)?shù)販p少循環(huán)數(shù)；
f．可以將復(fù)性溫度提高一些以減少引物二聚體形成。
（3）電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物呈片狀（smear）
a．需檢查一下Taq DNA聚合酶的用量，適當(dāng)?shù)販p少Taq酶的量有助于特異性條帶擴(kuò)增；
b．可以提高反應(yīng)的退火溫度，或者直接采用兩個(gè)溫度的PCR（68℃退火和延伸，94℃模板變性）；
c．適當(dāng)?shù)亟档蚆g ²⁺ 的濃度也可起到降低非特異性擴(kuò)增可能性的作用；
d．適當(dāng)?shù)販p少反應(yīng)退火的時(shí)間和延伸的時(shí)間；
e．適當(dāng)?shù)販p少循環(huán)次數(shù)也會(huì)有效果；
f．可以嘗試使用巢式引物PCR（nested primer PCR）。
（4）電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物出現(xiàn)其它非特異性條帶
a．需檢查一下引物的3’端是否有連續(xù)排列的G或C；
b．可以適當(dāng)?shù)靥岣咄嘶饻囟然蛑苯硬捎脙刹綔囟萈CR方法進(jìn)行擴(kuò)增；
c．可以降低Taq DNA聚合酶的用量，同時(shí)也降低引物的濃度；
d．可以適當(dāng)?shù)販p少退火所用的時(shí)間以及延伸反應(yīng)的時(shí)間；
e．可以適當(dāng)?shù)卦黾踊驕p少一些Mg ²⁺ 濃度。
4．假陽性
實(shí)驗(yàn)中設(shè)立的陰性對(duì)照可提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn)。如果一次實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)陰性對(duì)照中出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)陽性結(jié)果，提示本次實(shí)驗(yàn)中其它標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果可能有假陽性。造成假陽性的原因包括樣品污染、擴(kuò)增試劑污染、擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染等。常見的污染來源包括實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、加樣器、操作中形成的噴霧、DNA抽提儀器、試劑及任何與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的東西。
預(yù)防各種污染的措施主要有：（1）工作區(qū)隔離。（2）改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作，如在加樣過程中避免試劑飛濺、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用后棄去等。（3）操作程序合理化，如后加陽性對(duì)照等。


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 RT-PCR實(shí)驗(yàn)操作流程