膠體金標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程主要包含以下步驟：膠體金標(biāo)記蛋白的制備及其與膠體金之間的用量比例的確定、膠體金和蛋白的結(jié)合、膠體金標(biāo)記蛋白的純化與質(zhì)量檢測(cè)等。

1、蛋白質(zhì)的處理：膠體金標(biāo)記蛋白的制備

膠體金對(duì)蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

(1)待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過(guò)夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4℃離心1h，去除聚合物。

(2)待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時(shí)，調(diào)至9.0;標(biāo)記McAb時(shí)，調(diào)至8.2;標(biāo)記親和層析抗體時(shí)，調(diào)至7.6;標(biāo)記SPA時(shí)，調(diào)至5.9～6.2;標(biāo)記ConA時(shí)，調(diào)至8.0;標(biāo)記親和素時(shí)，調(diào)至9～10.

由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測(cè)定為宜。

由于鹽類成分能影響金溶膠對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對(duì)低離子強(qiáng)度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)澄清無(wú)細(xì)小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心除去。

一般情況下應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因?yàn)樗鼈兌伎晌接陬w粒表面而減弱膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。

2、蛋白質(zhì)zui適用量的選擇：膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定

(1)根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml.

(2)將標(biāo)記蛋白(以IgG為例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml～50µg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液。

(3)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。

(4)結(jié)果觀察，對(duì)照管(未加蛋白質(zhì))和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象;而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)zui低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的zui低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的zui低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加10%～20%。

將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質(zhì)5～40ug)加到 1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對(duì)照管，5分鐘后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混勻后靜置2小時(shí)，不穩(wěn)定的金溶膠將發(fā)生聚沉，能使膠體金穩(wěn)定的zui適蛋白量再加10%即為標(biāo)記蛋白量。

3、標(biāo)記：膠體金與蛋白質(zhì)(IgG)的結(jié)合

將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量：5%BSA使溶液終濃度為1%;1%聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/10.

在接近并略為高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的條件下標(biāo)記是比較合適的，在此情況下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量zui大。

下述標(biāo)記步驟zui為常見：

①用0、1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH(標(biāo)記SPA時(shí)調(diào)到pH6.0)。

②于100ml 金溶膠中加入標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液(體積為2～3ml)，攪拌2～3分鐘。

③加入5ml1%PEG20000溶液。

④于10000～100000g離心30～60分鐘(根據(jù)粒徑大小選擇不同離心條件)，小心吸去上清液(切忌傾倒)。

⑤將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以 A1cm/540nm=1.5左右為宜，以 0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4℃保存。

⑥包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G-200柱進(jìn)行凝膠層析分離純化，以含 0.1%BSA的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2，以A蛋白包被的金溶膠洗脫液為pH7.0.

4、膠體金標(biāo)記蛋白的純化

(1)超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。

用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金—羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心(20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min)20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g，4℃離心1h;20nm～40nm膠體金結(jié)合物，14 000g，4℃離心1h.仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3)，將沉淀重懸為原體積的1/10，4℃保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50%甘油可貯存于-18℃保存一年以上。

為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用10%～30%蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心，分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。

(2)凝膠過(guò)濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/5～1/10.再經(jīng)1 500r/min離心20min.取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝膠S-400)層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm，加樣量為床體積的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脫(內(nèi)含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG標(biāo)記物)，流速為8ml/h.按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時(shí)略混濁，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，zui后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過(guò)濾除菌、分裝，4℃保存。zui終可得到70%～80%的產(chǎn)量。

5、膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定

(1)膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量：用支持膜的鎳網(wǎng)(銅網(wǎng)也可)蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察?；蛴么姿徕檹?fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。

(2)膠體金溶液的OD520nm值測(cè)定：膠體金顆粒在波長(zhǎng)510nm～550nm之間出現(xiàn)zui大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA，0.02%NaN3)將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋，OD520=0.25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.2～0.4。

(3)金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法(MF-IGSSA)。將可溶性抗原(或抗體)吸附于載體上(濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜)，用膠體金標(biāo)記的抗體(或抗原)以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體，對(duì)金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。

本文詳述了膠體金標(biāo)記蛋白的操作步驟，在以上標(biāo)記的操作步驟中需要注意，所有溶液中均不可含雜質(zhì)微粒，可選用高速離心或微孔濾膜進(jìn)行預(yù)處理。

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