3-氨基苯硼酸-瓊脂糖

1 、產(chǎn)品介紹

NuPerley Boronate填料是在新一代高剛性瓊脂糖凝膠微球骨架的表面設(shè)計特定的間隔臂后，再偶聯(lián)3-氨基苯硼酸形成的親和層析介質(zhì)。苯硼酸配基在弱堿性條件下可與1,2-順式二醇通過可逆共價鍵形成硼酸酯，可特異性結(jié)合含1,2-順式二醇結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，包括糖蛋白（包括抗體）、酶、多糖、核苷、核苷酸和兒茶酚等多類生物分子。也可通過NADP+或ATP來輔助分離純化不能直接與填料結(jié)合的目標分子。因特異性高，且用途廣泛，使用本產(chǎn)品的純化過程可單獨歸類為硼酸親和層析（Boronate affinity chromatography，BAC）。

2 、產(chǎn)品特點與技術(shù)指標

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；b 10 cm 柱高下的測試流速。

3、硼酸親和原理

NuPerley Boronate與1,2-順式二醇結(jié)構(gòu)形成的可逆共價鍵（硼酸酯）是層析過程的主要作用力（圖 1）。pH=8.5 以上有利于填料與目標分子以硼酸酯的形式結(jié)合，但生物分子的分離純化較少用到pH=9.0以上的條件；pH=4.0~6.0則有利于硼酸酯的解離。除了可以降低pH將目標分子洗脫，也可以用山梨-醇、甘露-醇等含1,2-順式二醇結(jié)構(gòu)的糖 類進行競爭洗脫。

除了可逆共價鍵，配基中存在苯環(huán)這一疏水基團，可能與含苯環(huán)的物質(zhì)之間存在π-π相互作用，這要求上樣緩沖液的離子強度不能過高，通常在~50mM，以降低疏水相互作用造成的非特異性吸附。硼酸酯的四面體結(jié)構(gòu)帶負電荷，為降低離子相互作用造成的非特異性吸附，又要求結(jié)合過程有較高的離子強度。NuPerley Boronate 通常在50~500mM的離子強度下與目標分子有較優(yōu)的特異性結(jié)合。二價陽離子可降低離子相互作用和疏水相互作用造成的非特異性吸附，例如可在上樣緩沖液中加入0~50mM的MgCl2。Mg2+也可以抑制填料與核酸等含磷酸基團物質(zhì)的電荷互斥作用，加入Mg2+可以增強結(jié)合效果。

當(dāng)形成的硼酸酯以不帶電荷的平面三角形結(jié)構(gòu)存在時，硼原子存在空軌道，可作為電荷轉(zhuǎn)移相互作用的電子受體。未質(zhì)子化的氨基是良好的電子供體，當(dāng)氨基提供孤對電子給硼原子時，硼原子形成四面體型，促進硼酸酯的形成。但需要注意的是，當(dāng)氨基附近有羥基存在時，填料與1,2-順式二醇將無法形成硼酸酯結(jié)構(gòu)。這也是為什么乙醇胺和Tris不適合作為NuPerley Boronate的上樣緩沖液。

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完全讀取的穩(wěn)定體積。NuPerley Boronate的壓縮比為~1.10。為使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體積分數(shù)為67%），使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器），為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標記界面穩(wěn)定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。

4.3  平衡與上樣

在上樣前，可用上樣緩沖液（平衡緩沖液）在操作流速下平衡層析柱，觀察檢測器的變化，直到電導(dǎo)、pH 等參數(shù)不變。上樣量根據(jù)樣品的性質(zhì)和層析介質(zhì)的量進行選擇，可在預(yù)實驗中確定，例如靜態(tài)吸附實驗。一般需要將樣品用上樣緩沖液稀釋，例如1：1稀釋。

上樣緩沖液pH通常為8.5~9.0，例如將糖蛋白從非糖蛋白中分離可用HEPES緩沖液（20mM HEPES, 20mMMgCl2,pH 8.5），從脫氧核糖核苷中分離核糖核苷可用醋酸銨緩沖液（0.25 M 醋酸銨, pH 8.8）。本填料常用的上樣緩沖體系有磷酸鹽、醋酸銨、HEPES等，一般情況下應(yīng)避免使用含氨基的緩沖液，例如 Tris-HCl體系。

4.4 洗脫

用2-3個柱體積的平衡緩沖液沖洗上樣后的層析柱，觀察檢測器的變化，直到電導(dǎo)、pH等參數(shù)不變，此時未結(jié)合的組分被清洗出去。

親和層析柱的洗脫可用恒定洗脫、梯度洗脫或者階躍洗脫。洗脫過程可以將pH降低至4~6，例如0.1M 甲酸、25mM鹽酸；也可以選擇糖類進行競爭洗脫，如10~200mM山梨-醇；也可以用0~20 mM的EDTA；Tris可作為高效洗脫劑。

4.5  再生與在位清洗（CIP）

通常可用5 C 的洗脫液將填料再生。若有失活蛋白質(zhì)或脂類物質(zhì)在再生時洗不掉可用在位清洗（CIP）除去。可采用以下選擇進行在位清洗：0.5mol/LNaOH、70%乙醇、30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì)，反向效果更佳。

4.6 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存。也可以用0.2 M醋酸鈉、0.1M甲酸等與洗脫、再生接近的緩沖液保存，緩沖液中可添加0.02%疊氮-化鈉以防腐，在偏弱酸性的環(huán)境中填料更穩(wěn)定。保存溫度在2~8 ℃為宜，不可凍存。

3-氨基苯硼酸-瓊脂糖