羥脯-氨酸(HYP)測(cè)定試劑盒

（堿水解法）

一、測(cè)定原理:

羥脯-氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲

氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，根據(jù)其呈色的深淺可推算出

其含量。

二、試劑盒組成與配制：（50 管/48 樣）

試劑一：粉劑×1 瓶，甲液 10mL×1 瓶，乙液 20mL×1 瓶，

臨用時(shí)將粉劑一瓶，先加甲液 10mL 充分溶解（從

瓶口向內(nèi)看，溶解完）。然后再加乙液 20mL

充分混勻。配好后的試劑 4℃～8℃冰箱保存 3 個(gè)

月有效［注］：粉劑加甲液 10mL 后一定要溶

解后才能加乙液。

試劑二：液體 30mL×1 瓶，4℃冰箱避光保存 3 個(gè)月有效。

試劑三：粉劑×1 瓶，溶劑 30mL×1 瓶，臨用時(shí)將粉劑一支

加到 30mL 溶劑中充分溶解，配好后 4℃冰箱避光

保存 1 個(gè)月有效。

試劑四：羥脯-氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 5mg×3 支，4℃冰箱保存 6 個(gè)月。

100µg/mL 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制：測(cè)試前將一支標(biāo)準(zhǔn)品用雙

蒸水溶解后定容至 50mL，4℃冰箱保存 2 周。

5µg/mL標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制：取100µg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液1mL

加雙蒸水定容至 20mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣本前處理試劑（4℃保存）：堿水解液 60mL×1 瓶；調(diào) pH

指示劑 5mL×1；瓶；調(diào) pH 甲液 60mL×1 瓶；調(diào) pH

乙液 30mL×1 瓶；活性炭×1 袋。

三、羥脯-氨酸的測(cè)定：

（一）、樣本前處理：

1、樣本水解：

①、血清（漿）：取 0.5mL 血清（漿）準(zhǔn)確加水解液 1mL，

混勻。放試管中加蓋后，95℃或者沸水浴水解

20 分鐘。

②、尿液（培養(yǎng)液）：取 1.0mL 尿液（培養(yǎng)液）準(zhǔn)確加水

解液 1mL，混勻。放試管中加蓋后，95℃或者

沸水浴水解 20 分鐘。

③、組織：精確稱取組織濕重 30～100mg 放入試管中，準(zhǔn)

確加水解液 1mL，混勻。加蓋后 95℃或者沸

水浴水解 20 分鐘（水解 10 分鐘時(shí)混勻一次，

目的是使水解更充分）。

2、調(diào) pH 值至 6.0～6.8 左右。

①、將各試管流水冷卻后各管加指示劑 10μL，搖勻；

②、各管準(zhǔn)確加入調(diào) pH 甲液 1.0mL，混勻（此時(shí)溶液應(yīng)為

紅色）；

③、用 200μL 的加樣器吸取調(diào) pH 乙液向各管內(nèi)逐滴小心

加入調(diào) pH 乙液，每滴加入后均要混勻*，直至液體中

指示劑的顏色變成黃綠色**（亦即紅色消失時(shí)）。此時(shí)

pH 值在 6.0～6.8 左右（約加入調(diào) pH 乙液 100μL～

500μL 左右）；

* 加調(diào) pH 乙液時(shí)，每加一滴均要混勻，為防止液體外溢，

如果沒有帶蓋的玻璃磨口試管，可用普通玻璃試管代

替，每次混勻時(shí)可用塑料薄膜或冰箱保鮮膜壓住試管

口，充分旋渦混勻即可。

**若您的樣本是細(xì)胞培養(yǎng)液，因其中含有酚紅，所以液體

中的混合指示劑在 pH 為 6.0～6.8 左右時(shí)為橙黃紅色，

而不是黃綠色。

④、然后加雙蒸水至 10mL，混勻；

⑤、取 3～4mL 稀釋的水解液加適量活性炭（約 20～30mg

左右，以上清液離心后澄清無色為準(zhǔn)），混勻，3500

轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘，小心取上清 1mL 作檢測(cè)。

注 1：樣本堿水解法的參考取樣量：皮膚組織濕重 0.03～

0.05g，軟骨濕重 0.08～0.1g，肝組織濕重 0.08～0.1g，

細(xì)胞培養(yǎng)液 0.5mL，血清（漿）0.5mL。

注 2：加水解液及調(diào) pH 值甲液一定都要準(zhǔn)確，否則較難調(diào)

PH 值。

注 3：樣本稱重時(shí)，一定要很精確，以免影響測(cè)定結(jié)果。先

將組織在保鮮薄膜上剪成濕重約 10mg 左右的塊狀后

再連同保鮮薄膜一起稱重，稱完后將樣本放進(jìn)試管中，

再將保鮮薄膜稱重，計(jì)算出組織凈重量。

注 4：如果您的樣本量少，則可以從取樣、水解、調(diào) pH

均按比例減少，不影響結(jié)果。

注 5：每次混勻時(shí)可用塑料薄膜或冰箱保鮮膜壓住試管口，

充分旋渦混勻，以免混勻過程中液體外濺。

注 6：95℃或者沸水浴時(shí)可以用帶蓋的玻璃磨口試管，也

可用普通玻璃試管代替，用保鮮薄膜封口扎緊，用

針頭刺一小孔即可。我們建議用普通玻璃試管比帶

蓋的玻璃磨口試管更安全。

五、測(cè)定意義：

羥脯-氨酸在膠原蛋白中占 13.4%，在彈性蛋白中占極少

量，其它蛋白中均不存在。而膠原蛋白大多分布在皮膚、

腱、軟骨、血管等處，因此羥脯-氨酸的量能反映結(jié)締組織

疾病的膠原代謝情況。

有人把皮膚中羥脯-氨酸的測(cè)定作為篩選抗衰老藥物的

一個(gè)指標(biāo)。在發(fā)育階段隨年齡的增長，其羥脯-氨酸在尿中

排泄增加，而發(fā)育停止后穩(wěn)定。老年人的羥脯-氨酸比年輕

人要少。

鼠患有自發(fā)性高血壓及繼發(fā)性高血壓時(shí)，尿中羥脯-氨酸

含量增加。

手術(shù)創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致尿羥脯-氨酸排泄量的增加，因高脂、低

蛋白、酒精中毒及毒物、營養(yǎng)不良，或肝細(xì)胞變性壞死，

通過炎癥使纖維增加，分割肝小葉，導(dǎo)致肝硬化。肝纖維

化時(shí)，肝內(nèi)主要增加的成分為膠原纖維，羥脯-氨酸為膠原

纖維所特-有，測(cè)定肝羥脯-氨酸的含量，可換算成肝膠原蛋

白的含量，以反映肝纖維化程度。膠原纖維分解主要依賴

膠原酶和其它蛋白酶的作用，其分解產(chǎn)物羥脯-氨酸從尿中

排出，測(cè)定尿羥脯-氨酸的含量，可反應(yīng)膠原降解的情況。

通過測(cè)定組織及尿中羥脯-氨酸的含量，一方面可以判斷纖

維化程度，同時(shí)可以篩選預(yù)防與治療的藥物。

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